Термин биотехнология появился в середине 70х годов. Широкое толкование термина биотехнология включает биотехнологическое производство и микробиологическое производство антибиотиков, витаминов, белков, производство пива, дрожжевого хлеба и др. Современная биотехнология представляя собой новую форму биологической промышленности требует специального технического оснащения, опирается на электронику, молекулярную биологию, генетику и ряд других современных областей знаний. В зависимости от задач выделены следующие уровни приложения биотехнологических и генетико-инженерных методов: молекулярный, генный, хромосомный, уровень плазмид, клеточный, тканевый, организационный, популяционный. В настоящее время успешно развивается клеточная биотехнология, которая базируется на использовании культуры клеток, тканей и протопластов. Клеточные технологии используются в 3х направлениях. Первое связано со способностью изолированных растительных клеток продуцировать ценные для медицины, парфюмерии, косметики и других отраслей промышленности вещества вторичного синтеза: алкалоиды, стероиды, гликозиды, гормоны, эфирные масла и др. Второе направление – использование изолированных тканей для ускоренного клонального микроразмножения и оздоровления посадочного материала от других вирусов и других патогенов. Третье направление – использование изолированных клеток в селекции растений для придания им устойчивости к различным стрессам: засухе, низким и высоким температурам и др., а также для получения неполовых (соматических) гибридов.
Перенос в изолированные пропласты чужеродных генов с помощью методов генной инженерии позволяет получать растения с новыми наследуемыми свойствами (трансгены).
Культивирование изолированных пыльников и семяпочек на искусственных питательных средах дает возможность получать гаплоиды. Культивирование зародышей – прием, с помощью которого можно получать растения из невсхожих гибридных семян. Оплодотворение в пробирке – прием, преодолевающий нескрещиваемость видов при отдаленной гибридизации.
В развитии клеточных технологий выделено VII этапов:
I этап (1892-1902гг.) Первые попытки культивирования различных растительных тканей. Была высказана гипотеза тотипотентности любой живой растительной клетки, т.е. способности клеток реализовывать свой потенциал развития и давать начало образованию целого растения.
II этап (1902-1922гг.) Создание первых питательных сред для культивирования тканей животных.
III этап (1922-1932гг.) Разработка культивирования растений на твердых питательных средах.
IV этап (1932-1940гг.) Разработка приемов длительного культивирования в условиях in vitro растительных тканей за счет периодического пересаживания их на свежую питательную среду.
V этап (1940-1960гг.) Открытие фитогормонов цитокининов, в свзи с этим появление возможности стимуляции деления клеток, поддержания растительного каллуса, индуцирования морфогенеза.
VI этап (1960-1975гг.) Разработка метода получения ферментативным путем изолированных протопластов. Осуществление искусственного слияния протопластов и появление нового пути к созданию соматических гибридов. Разработка метода микроразмножения растений в условиях in vitro.
VII этап (1975г. по н.в.) Происходит развитие техники in vitro, разрабатываются методы электрослияния изолированных протопластов, методы мутагенеза и клеточной селекции, методы получения гаплоидных растений, совершенствование метода глубинного культивирования клеток с использованием изолированных протопластов и векторов, созданных на основе Ti и Ri плазмид.
Биотехнология в животноводстве успешно развивается в направлении оплодотворения in vitro, трансплантации эмбрионов, получения однояйцевых близнецов, межвидовых пересадок эмбрионов и получения химер. Успешно развивается генноинженерное направление.
Другим очень важным направлением биотехнологии является генная инженерия. Генная инженерия – раздел молекулярной биологии, направленный на конструирование in vitro новых комбинаций генетического материала, способного размножаться в клетке и синтезировать определенный продукт.
Используя методы генной инженерии в настоящее время обеспечивается экспрессия генов человека или животного в клетке микроорганизма или другого объекта и имеется реальная возможность получать в необходимых количествах дефицитные активные вещества и фармацевтические препараты, в их числе инсулин, гормоны роста, интерферон ?, ?, ?, интерлейцин 2, вакцина против гепатита В, вакцина против ящура, фактор крови VIII, IV и др.
Генная инженерия решает такие важные задачи, как:
- получение генов путем выделения их из клеток или синтеза;
- получение рекомбинантных молекул ДНК;
- клонирование генов;
- введение генов в клетку и синтез чужеродного ей белка.
В развитии генной инженерии большую роль сыграли методы получения индивидуальных генов и их клонирование или практически неограниченное размножение в бактериальных клетках.
Техника генной инженерии включает выделение индивидуальных фрагментов ДНК любого происхождения, их стабильное воспроизведение в составе векторов, идентификация функций клонированных таким образом генов, их изменение и введение в клетки исходного или иного организма. Эта техника называется техникой рекомбинантной ДНК.
Первый успешный эксперимент по выделению гена, а точнее группы генов лактозного оперона (lac-оперон) E. Coli был выполнен в 1969г. в лаборатории Дж. Беквита. Этот эксперимент принято считать началом генной инженерии. Главную роль на этапе выделения гена отводят ферментам эндонуклеазам рестрикции, или рестриктазами. Рестриктаза разрезает ДНК вблизи или внутри определенных последовательностей нуклеотидов. Два разрыва в одинаковых позициях комплиментарных цепей на концах фрагмента образуют «липкие концы», которые могут вновь замыкаться, благодаря комплиментарности оснований. Затем, среди смеси рестрикционных фрагментов необходимо найти нужный ген (эта задача является довольно трудоемкой). По этому, наиболее распространенным является способ химического синтеза генов. Методология синтеза ДНК с заданной последовательностью нуклеотидов была разработана Г.Кораной в 60-х годах. В настоящее время созданы специальные автоматы для синтеза ДНК заданной последовательности.
Химический и энзиматический синтез генов имеет лпределенные преимущества перед их поиском среди рестрикционных фрагментов.
Для выделения нужного фрагмента ДНК в необходимых количествах его следует выстроить в плазмиду-вектор, вскрытую той же рестриктазой, которую использовали для получения рестректов геномной ДНК. В настоящее время работают с искусственными рекомбинантными плазмидами, которые несут два или три гена устойчивости к антибиотикам, как маркерные гены и содержащие по одному уникальному сайту рестрикции. Это плазмиды рВR 322, 324, 325 и др. В качестве векторов используют ряд природных плазмид, например Col El, которая способна амплифицироваться до 1000 копий на 1 клетку E.Coli, вместе с ней клонируется и введенный в нее ген.
Трансформированные клетки можно отобрать в среде с соответствующим антибиотиком.
Большие задачи ставит перед генной инженерией селекция растений. На устойчивость к наиболее опасным вредителям и болезням, устойчивость к стрессам, гербицидам, солеустойчивость и др.
Еще Аристотель в IV веке до н.э. описал опухолевые заболевания растений корончатый галл. Установлено, что это заболевание вызывает почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens и причиной образования опухолей является Ti-плазмида этих бактерий.
Ti-плазмиды способны проникать из бактерий в клетки растений и часть ДКН Ti-плазмиды, получившая название Т-ДНК, ковалентно встраивается в хромосомы инфицируемого растения. При этом Т-ДНК вызывает образование опухоли и индуцирует синтез фитогормонов, а также ряда производных аминокислот – опинов. Опины служат пищей для бактерии. Этот механизм инфекции и используют для введения в растения чужеродных генов.
Операция сводится к включению нужного гена в сайт Т-ДНК и к трансформации клетки растений такой рекомбинантной плазмидой. Клетка должна регенирировать в полноценное растение, причем встроенный ген лишает Т-ДНК способности к образованию опухоли. Встраивание клонированного таким путем сегмента ДНК (трансгена) в ДНК клетки-хозяина и регенерация ее в полноценный организм – перспективный путь создания трансгенных организмов, как растений, так и животных.
Для создания трансгенных сельскохозяйственных растений начали применять методы альтернативные генетической трансформации. Широко используется доставка вектора в мишень с помощью высокоскоростной баллистической трансдукции, метод введения чужеродной ДНК методом электрофореза в геле на агар-агаре.
С помощью генно-инженерных методов созданы сорта сахарной свеклы, устойчивые к вирусу ризомании. Генная инженерия особенно перспективна при изучении процессов развития и дифференциации растений, что очень важно для оптимизации селекционного процесса.
Молекулярная биология предлагает также методы диагностики вирусных заболеваний и идентификации фрагментов хромосом.
Вопросы для самоконтроля
Представьтесь*
Ваш комментарий*
